Информационный сайт Щелково

Жми сюда! Щёлково

ЛЮДИ РАЙОНА (администрация) / Хруленко Владимир Николаевич.

Хруленко Владимир НиколаевичЗаместитель главы администрации Щёлковского муниципального района — председатель комитета по вопросам здравоохранения Хруленко Владимир Николаевич.

Сфера компетенции Хруленко Владимира Николаевича: здравоохранение Щёлковского района, в том числе: организации оказания на территории муниципального района первичной медико-санитарной помощи в амбулаторно-поликлинических, стационарно-поликлинических и больничных учреждениях; скорой медицинской помощи (за исключением санитарно-авиационной); медицинской помощи женщинам в период беременности, во время и после родов;
- создания, развития и обеспечения охраны лечебно-оздоровительных местностей и курортов;
- взаимодействие со Щёлковским управлением социальной защиты населения.

Орган администрации Щёлковского муниципального района — комитет по вопросам здравоохранения, муниципальные учреждения здравоохранения.

Хруленко Владимир Николаевич осуществляет руководство комиссиями; взаимодействие с государственными органами и организациями, коммерческими и некоммерческими организациями, общественными и политическими объединениями:
- санитарно-противоэпидемиологическая комиссия;
- комиссия по восстановлению прав реабилитированных жертв политических репрессий.

В государственных органах и организациях:
- Щёлковское управление социальной защиты населения Министерства социальной защиты населения Московской области;
- ФГУ «Главное бюро медико-социальной экспертизы по Московской области» филиал № 5;
- Территориальный отдел управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Московской области в городах Королёв, Фрязино, Лосино-Петровский, Юбилейный и Щёлковскому району;
- ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области в городах Фрязино, Лосино-Петровский, Щёлковском районе»;
- государственные организации здравоохранения;
- медицинские и страховые организации;
- соответствующие общественные объединения граждан.

Хруленко Владимир Николаевич состоит в общественных организациях:
- Российская диабетическая ассоциация;
- Региональная общественная организация «Российский Красный Крест»;
- Щёлковская районная общественная организация Всероссийского общества инвалидов;
- Щёлковская районная организация Всероссийского общества слепых;
- Московская областная ассоциация инвалидов — жертв политических репрессий.

Начальник Хруленко Владимир Николаевич 8(496 56) 6-62-80

Хруленко Владимир Николаевич - Предеседатель Комитета по вопросам здравоохранения Администрации Щёлковского муниципального района

Диссертационная работа: Хруленко Владимир Николаевич. Анализ эпизоотических и эпидемических процессов при туберкулезе и совершенствование методов диагностики : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.01.06 / Хруленко Владимир Николаевич; [Место защиты: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН].- Щелково, 2010.- 24 с.: ил. РГБ ОД, 9 11-1/3179

На правах рукописи

ХРУЛЕНКО ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ АНАЛИЗ ЭПИЗООТИЧЕСКИХ И ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.02.02-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2010 г.

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Матвеева Ирина Николаевна

Научный консультант: доктор биологических наук Букова Наталья Константиновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, Заслуженный ветеринарный врач РФ Скичко Николай Данилович доктор биологических наук, профессор Безгин Вячеслав Михайлович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии

Защита состоится 24 декабря 2010 года в 10 часов на заседании дис-сертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промыш-ленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП. E-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссий-ский научно-исследовательский и технологический институт биологиче-ской промышленности» Россельхозакадемии

Автореферат разослан 23 ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Успех борьбы с туберкулезом зависит от полноты учета всех возможных источников возбудителя болезни и связана с видами микобактерий, патогенетическую роль которых изучают медицинские и ветеринарные исследователи (Г.А. Юдин, 1974; И.А. Косилов, 1976; О.А. Благодарный, 1980; Н.П. Овдиенко, 1990; Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев, 2005; Ю.И. Смолянинов, 1997; А.С. Донченко, 1997; Н.А. Донченко,1998; В.Г. Ощепков , 2000; А.П. Лысенко, 1994; Т.Н.Агеева, 2005).

Огромный опыт борьбы с туберкулезом позволил разработать систему профилактических, противоэпизоотических, противоэпидемических и лечебных мероприятий, вполне оправдавших себя в регионах России. Однако в настоящее время повысилась важность изучения и учета конкретных природно-географических и хозяйственно-экономических особенностей каждого региона, влияющих на динамику эпидемического процесса туберкулеза в сложившихся условиях.

Поэтому, актуальным является выяснение современных аспектов эпидемиологии и эпизоотологии туберкулеза, значения микобактериозов в патологии крупного рогатого скота, свиней и птиц, выявления источников и путей инфицирования животных нетуберкулезными микобактериями для совершенствования системы противоэпидемических и противоэпи-зоотических мероприятий в зоонозных очагах туберкулеза.

Одной из причин поддержания длительного неблагополучия по туберкулезу является инфицированность молодняка, обычно обладающего низкой реактивностью к туберкулину (Н.А. Донченко, 2008). Поэтому актуальна разработка диагностики ареактивного к туберкулину молодняка сельскохозяйственных животных (Н.А. Донченко, 2010; стандарт МЭБ (QIE Manual, Chapter 2.4.7, май 2009).

Для иммуноферментной диагностики туберкулеза у человека и животных испытывались микобактериальные антигены разной специфичности и степени очитки (Е.В. Маслов, 1986; Л.М. Ходун, 1990; Н.И. Цунская, 1988; А.П. Лысенко, 1994., Fifis J. et al.,1994., M.Harboe et al., 1990; Н.О Шимолина, 2000; А.А. Нуруллин, 1987; Н.В. Демьяненко, 1993; Л.К. Шипина, 1997;Л.А. Таллер, 1995; Т.Р. Якупов, 1991). Использование высокоочищенных видоспеци-фических антигенов микобактерий не нашло широкого применения из-за их низкой чувствительности при выявлении больных животных в серологических тестах (Т.Н. Агеева 2005). Невысокая результативность методов серологической диагностики при туберкулезе связана с быстрым включением синтезирующихся антител в иммунные комплексы с антигенами возбудителя (М.М. Авербах, 1984, Л.К. Суркова, 1998, А.П. Лысенко и др., 1998).

Современные достижения в области биотехнологии делают вполне, возможным получение компонентов иммуноферментной тест-системы, позволяющих достичь максимальной чувствительности и специфичности.

Целью исследований являлось анализ проявлений эпидемического и эпизоотического процессов с усовершенствованием противотуберкулезных мероприятий, включая получение компонентов диагностических тест-систем.

Основные задачи исследований:
- изучить эпидемическую ситуацию при туберкулезе;
- провести бактериологические исследования биоматериала от сельскохозяйственных животных в Московской области;
- выяснить проявление микобактериозов среди поголовья крупного рогатого скота отдельных общественных хозяйств Московской области;
- исследовать объекты внешней среды на наличие нетуберкулезных микобактерий;
- оптимизировать систему медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза;
- выделить из клеточной стенки бактерий антигены, стимулирующие выраженный гуморальный ответ;
- получить специфические противотуберкулезные сыворотки;
- оптимизировать технологию получения коньюгата для иммуно-ферментного анализа;
- усовершенствовать метод диагностики туберкулеза ИФА (имму-ноферментный анализ) путем получения высокоспецифичных компонентов.

Научная новизна. Впервые проведен анализ результатов бактериологических исследований туберкулеза в Московской области за 2000-2007 гг. Изучена частота выделения и спектр возбудителей туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий, персистирующих в организмах животных и среде их обитания на территории Московского области.

Впервые проведен сравнительный анализ значения различных эпи-демиологических и эпизоотологических показателей для характеристики сельских очагов туберкулеза. С учетом указанных критериев охарактеризованы многолетняя динамика, тенденции и особенности проявлений эпидемического и эпизоотического процессов туберкулеза в Московской области.

Проанализирован видовой спектр микобактерий, персистирующих в организме животных и на объектах внешней среды.

Оптимизирована система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза.

С помощью современных биотехнологических и иммунобиологиче-ских методов усовершенствованы способы получения компонентов, при-меняемых для постановки иммуноферментного анализа при туберкулезе животных.

Практическая ценность работы. Результаты исследований исполь-зованы при составлении: «Методических рекомендаций по диагностике микобактериальных инфекций у животных», утвержденных директором Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 22 марта 2007 года; Методических рекомендаций «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденных директором ВИЭВ, академиком РАСХН М.И. Гулюкиным, директором ВНИТИБП, академиком РАСХН А.Я. Самуйленко и директором «Центра ветеринарии» Л.К. Кишем 25 мая 2009 г., «Планов профилак-тическо-диагностических мероприятий по профилактике туберкулеза человека и животных в Московской области», утвержденных Главным врачом областного противотуберкулезного диспансера Московской области Г.Б. Касаткиным в 2008 г.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на совещании коллектива Московского областного противотуберкулезного диспансера (2007 г. ); в Министерстве сельского хозяйства Московской области (2007, 2008 гг.); на заседаниях ученого совета ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (2007, 2008 гг.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-результаты анализа динамики проявлений эпидемического и эпизоотического процессов туберкулеза в Московской области за 2001-2007 гг., -результаты бактериологических исследований биоматериала сельскохозяйственных животных и проб объектов внешней среды в Московской области на наличие микобактерий и их видового состава;
-результаты исследований по проявлению микобактериозов живот-ных в отдельных общественных хозяйствах Московской области;
-результаты эпидемиологических и эпизоотологических обследова-ний очагов туберкулеза в сельской местности;
-система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах ту-беркулеза;
-результаты исследований по усовершенствованию постановки им-муноферментного анализа для диагностики туберкулеза.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых изданиях, входящих в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 20 таблицами, 1 схемой. Список литературы включает 263 источника, из них 175 иностранных.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам Московского областного и Щелковского противотуберкулезных диспансеров, Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Московской области, РНИУП Института

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена в период с 2005 по 2008 гг. в лаборатории микробиологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» в рамках задания 01 Российской научно-технической программы приоритетных и прикладных научных исследований.

2.1. Материалы и методы

В работе использовали комплекс микробиологических, иммунологических, биотехнологических и молекулярно-биологических методов. Исследования проводили согласно стандарту МЭБ (QIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.4.7., 2009.

Сводку, группировку и анализ собранной информации проводили с использованием методов по «Методическим указаниям по эпизоотологическому исследованию» (И.А. Бакулов и соавт., 1982). Исследование животных на туберкулез проводили совместно с ветеринарными специалистами в соответствии с Санитарными и Ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями для человека и животных», утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Минсельхозпродом России (1996), «Наставлением по диагностике туберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации 18.11.2002 г.; «Методам лабораторной диагностики туберкулеза», ГОСТ 26072-89; СТ СЭВ 3457-81.

В исследованиях использовали эталонные музейные, официально зарегистрированные штаммы культур патогенных и атипичных микобактерий. Микобактерии выращивали на плотных и жидких средах (Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Сотона, Школьниковой, Павловского, ВКГ), выделение антигена из клеточной стенки проводили по методике И.Н. Архипова, А.П. Лысенко и др. с модификациями, 1991.

Культурально-биохимические свойства изолированных кислото-устойчивых культур микобактерий изучали во второй генерации после накопления бактериальной массы, согласно методическим указаниям «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» М.1981; учет и оценку выросших колоний проводили по схеме Г.Н. Першина (1971). Также использовали тесты согласно схеме дифференциации микобактерий, разработанной в ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко с учетом модификаций, предложенных Н.М. Макаревич с соавт. 1985 и другими учеными. Отрицательным контролем служила эмбриональная сыворотка и сыворотка крови коров из благополучных по туберкулезу хозяйств Московской области.

Гуморальный иммунный ответ изучали по методике, разработанной сотрудниками РНИУП Института Экспериментальной ветеринарии им. Вышелесского НАН Республики Беларусь, в перекрестном иммуно-электрофорезе (ПИЭФ) с промежуточным гелем (ПГ). Результаты интер-претировали по Н. Аксельсен с соавт. (1974).

Специфические положительные противотуберкулезные сыворотки получали гипериммунизацией кроликов антигеном M. bovis. В качестве блокирующих антител при постановке непрямого жидкофазного варианта ИФА использовали противотуберкулезные антитела из сыворотки крови кроликов, иммунизированных иммунодоминантными антигенами M. bovis с адъювантом полиоксидонием, очищенных методом аффинной хроматографии на BrCN сефарозе с иммобилизованным на ней гомологичным антигеном, и активностью в ИФА не ниже 1:2560. Постановку блокирующего ИФА (Б-ИФА) проводили по стандартной методике (Gy Czifra,1993).Оптимальную концентрацию блокирующих антител и антивидового конъюгата определяли путем постановки прямого варианта ИФА методом двукратных последовательных разведений по схеме «шахматный порядок». За рабочее разведение компонента принимали последнее разведение каждого, обеспечивающего оптическую плотность (ОП) равную 2,0 единицы. Рабочее разведение антигена для Б-ИФА определяли в непрямом варианте ИФА. Титром антигена считали последнее его разведение, при котором положительная контрольная сыворотка имела наивысший титр, определенный в реакции со стандартным контрольным антигеном. Удвоенное значение конечного разведения антигена считали рабочим. Полученные в результате реакции Б-ИФА значения ОП контрольных и исследуемых проб с блокирующими антителами переводили в значение процента блокирования (Б%).

Выделение и очистка IgG КРС. IgG КРС выделяли из нормальной и гипериммунных противотуберкулезных сывороток крови методом аффинной хроматографии на BrСN-Сефарозе 4В с иммобилизованным протеином А. Общий белок определяли по методу Лоури (1958) и спектрофотометрически на СФ-26 при длине волны 280 нм. Коньюгат анти-IgG КРС антител получали меткой антивидовых антител ферментом пероксидазой из хрена перйодатным методом по P. Nakane и A. Kawaoi (1974).

2.2. Результаты исследований

Важным является вопрос о выяснении взаимного влияния в настоя-щее время эпидемического и эпизоотического процессов друг на друга и насколько оно выражено. Нами проведено сравнение основных эпидемиологических и эпизоотологических показателей туберкулеза на территории Московской области.

2.2.1.Анализ эпидемической ситуации по туберкулезу. Анализ показал, что в Российской Федерации (РФ) в 2000 г. отмечены высокие показатели заболеваемости и смертности населения от туберкулеза. С 2001 г. началось постепенное снижение значения показателя заболеваемости с 88,5 (2001г.) до 82,4 (2006г.) на 100 000 населения. Показатель заболеваемости туберкулезом сельских жителей превышал городских жителей на 11 %. Смертность среди больных туберкулезом увеличилась в 2,8 раза.

Показатели заболеваемости и смертности людей от туберкулеза в Московской области, представленные в сравнении с аналогичными данными по России (табл.1), ниже, чем в среднем по России, но остаются довольно высокими. В сельской местности заболеваемость выше, чем в городской на 28%. Резервуар туберкулезной инфекции продолжает расти, создались условия для возникновения новой популяции микобактерий туберкулеза, устойчивых к специфическим противотуберкулезным препаратам.

В Щелковском районе Московской области эпидемическая ситуация по туберкулезу все еще находится на достаточно высоком уровне (табл. 2). Если в 2000-2005 гг. наблюдалась тенденция к сближению показателей заболеваемости туберкулезом жителей городской и сельской местности, то в 2006 и 2007 гг. заболеваемость и смертность сельских жителей увеличилась, что потребовало поиск возможных источников заражения людей. Таблица 2

Показатели заболеваемости и смертности населения туберкулезом в Щелковском районе Московской области за 2000-2007 гг (на 100 тыс. населения).

Анализ эпизоотологической информации показал, что эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации проявляет тенденцию улучшения. Снижается количество эпизоотических очагов, уменьшается заболеваемость животных и количество туш с патологическими изменениями, характерными для болезни. Если на 01.01.92 г. было 1007 неблагополучных пунктов, то на 01.01.08 их осталось только 56, т.е. почти в 20 раз меньше. Коэффициент очаговости снизился с 64,9 в 1992 г. до 34.9 в 2007 г. Число случаев послеубойного выявления патологиче-ских изменений, характерных для туберкулеза, уменьшилось на 68,7%.

Широкомасштабные мероприятия по оздоровлению поголовья крупного рогатого скота Московской области начались с 1953 г. Однако в отдельных районах области вновь появились неблагополучные по туберкулезу пункты (табл.3). Это свидетельствует о том, что эпизоотический процесс туберкулеза в области не прерывался.

Следует отметить, что в неблагополучных хозяйствах была проведена запоздалая диагностика болезни с высокой заболеваемостью поголовья скота, и их оздоровление проводилось методом полной замены поголовья животных. Кроме того, среди убитых животных на мясокомбинатах выявляли туши с патологическими изменениями, характерными для туберкулеза. Это свидетельствует о несвоевременной диагностике и о невыясненной эпизоотической ситуации по туберкулезу среди поголовья скота области.

Замечено, что в период наибольшего распространения туберкулеза крупного рогатого скота в Московской области был широко распространен и туберкулез кур. При подтверждении диагноза поголовье ликвидировали, но остались инфицированные участки, и эпизоотический процесс не прерывается. В него могли включаться синантропные виды диких птиц, домашние и дикие животные, и, возможно, человек. Это необходимо учитывать при эпидемиологическом и эпизоотологическом обследовании сельских очагов туберкулеза.

2.2.2. Бактериологические исследования биоматериала от крупного рогатого скота, свиней на наличие микобактерий

Данные доступной литературы и материалы собственных наблюдений позволяли поставить вопрос о необходимости учета выделения разных видов микобактерий от животных и, соответственно, изучения их роли в эпидемическом и эпизоотическом процессах.

Результаты анализа показали, что ежегодно в ветеринарных лабораториях страны за 2001-2007гг. проводилось от 18 до 22,4 тыс. бактериологических исследований на туберкулез (в среднем за год 19,0 тыс.). Подавляющее количество выделенных культур из биоматериала от крупного рогатого скота приходится на М. bovis - в среднем 56,3% в год. Удельный вес изолированных из биоматериала от крупного рогатого скота культур М. tuberculosis составил в среднем 1,4% в год. Удельный вес М. avium в структуре видовой принадлежности культур микобактерий, изолированных от крупного рогатого скота, был ниже и составил в среднем 0,8% в год. Культуры нетуберкулезных микобактерий составили в среднем 41,7% в год. При дифференциации 1052 культур нетуберкулезных микобактерий установлено, что 40 из них (3,9%) отнесены к фотохромогенным (1 группа); 235 (22,3%) - к скотохромогенным (2 группа); 155 (14,7%) -- к нефотохромогенным (3 группа) и 625 (59,2%) - к быстрорастущим микобактериям (4 группа классификации Раниона).

2.2.3. Микобактериозы крупного рогатого скота в хозяйствах Московской области

Анализ статистических данных и результатов исследований показали, что на фоне выявления единичных неблагополучных пунктов по туберкулезу крупного рогатого скота, увеличилось число хозяйств и животных, у которых реакции на туберкулин обусловлены инфицированием нетуберкулезными микобактериями. Микобактериозы крупного рогатого скота выявлены в 44 хозяйствах 17 административных районов области. Степень их распространения в стадах варьировала от 0,08 до 2,5%, в среднем 0,2% в год. На 100 тысяч голов скота выявлялось от 107,6 до 340,3 случаев, в среднем 206,1 случаев микобактериозов. Максимальная частота инфицирования крупного рогатого скота нетуберкулезными микобактериями уста-навливалась в ОПХ «Красная пойма» Луховицкого района и ОПХ «Щапово» Подольского района. Это крупные хозяйства, где на одной ферме находилось 1200-2300 голов скота. В этих хозяйствах при исследовании выявлено от 20 до 100 реагировавших животных. Реагировали на туберкулин в основном коровы. Среди телят до года и молодняка старше года выявляли лишь единичные случаи. Бактериологическим исследованием среди поголовья крупного рогатого скота ОПХ «Щапово» установлен микобактериоз, обусловленный М.аvium, а среди поголовья ОПХ «Красная пойма» - ассоциацией нетуберкулезных микобактерий.

2.2.4. Микобактериозы свиней в хозяйствах Московской области

В отдельных хозяйствах Московской области регистрировали микобактериозы свиней, обусловленные в основном микобактериями комплекса М. аvium, М. intracellulare. Массовое проявление микобактериозов выявляли при комплектовании откормочных комплексов свиней, завозимых из разных областей Российской Федерации и республик бывшего Советского Союза. Так, в комплексе совхоза «БД» и совхоза - комплекса «К» - при убое на мясокомбинате у 2866 из 4008 убитых свиней выявили патологические изменения, характерные для туберкулеза. При аллергическом исследовании 325 свиней в возрасте от 6 до 10 мес. туберкулином для млекопитающих и для птиц выявили 264 (81,2%) животных, реагировавших на туберкулин для птиц. В отдельных станках реагировали 100 % свиней. В качестве добавок к основному рациону свиньям скармливали необработанный торф, завезенный из Эстонии, пудрет (куриный помет) и яйцо - бой с птицефабрики. Для выяснения источника заражения свиней микобакте-риями исследовали пробы торфа, пудрета и яйцо - бой. Одновременно исследовали и биоматериал от 4 свиней. В результате бактериологических исследований из двух проб биоматериала и из пробы торфа выделено 3 культуры кислотоустойчивых микобактерий. Изучение культурально-морфологических и биологических свойств (на морских свинках, кроликах и курах) культур, выделенных из биоматериала от свиней и из проб торфа, позволило идентифицировать микобактерии туберкулеза птичьего вида. Исключение торфа из рациона свиней позволило предотвратить появление туберкулеза среди свиней обеих хозяйств.

2.2.5. Эпидемиологическое и эпизоотологическое обследование сельских очагов туберкулеза

Туберкулез как общебиологическая проблема здравоохранения и ветеринарной медицины требует всестороннего обследования эпидемических и эпизоотических очагов болезни, выяснения всех источников возбудителей инфекции и конкретизации мер профилактики и оздоровления.

При обследовании 40 сельских очагов в Щелковском районе Московской области не выявлено реагирующих на туберкулин среди исследованных 90 кур, 16 свиней, 17 собак и 20 кошек. Из 15 обследованных коров реагировала на туберкулин для млекопитающих одна корова, у которой при комплексном исследовании было исключено инфицирование ее возбудителем туберкулеза.

В Подольском районе в индивидуальном секторе (7 населенных пунктов) обследование аллергической пробой на туберкулез проводили 45 голов крупного рогатого скота и 744 курицы. Среди крупного рогатого скота не выявили реагирующих на туберкулин животных, а среди кур реагировало на туберкулин для птиц 8 голов (1,0%). При убое этих кур у 6 голов в печени обнаружены патологические изменения туберкулезного характера. При бактериологическом исследовании биоматериала от 4 из убитых кур выделили М. аvium. Эти куры находились в одном очаге туберкулеза, где от больного человека, находящегося в этом очаге, был выделен возбудитель туберкулеза человеческого вида. В остальных очагах туберкулеза, реагирующих животных на туберкулин, не выявлено.

В населенном пункте, где находился молочный комплекс «Щапово», при аллергическом исследовании из 1917 коров выявили 252 головы, реагирующих на туберкулин для млекопитающих (13,1%). Проведенные дополнительные аллергические исследования симультанной пробой с туберкулином для млекопитающих и КАМ, а также бактериологические исследования биоматериала от 26 коров установлено, что причиной аллергических реакций было инфицирование животных М. avium.

В одном из районов исследовали на туберкулез 1737 голов крупного рогатого скота в 194 населенных пунктах, и выявили 18 реагирующих на туберкулин животных (1,0%). У одного из 8 убитых, реагирующих на туберкулин животных, при осмотре органов и туш выявили изменения, характерные при туберкулезе. При бактериологическом исследовании биоматериала выделена культура M. bovis. Как оказалось, эта корова находилась в очаге туберкулеза и была приобретена в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве.

Аллергическим исследованием 207 голов крупного рогатого скота, 57 свиней, 1507 кур и 67 гусей личных хозяйств 7 населенных пунктов (55 дворов) выявили 48 коров, 1 быка и 6 телок (26, 8%), реагирующих на туберкулин. В 25 дворах (45,4%), где был выявлен реагирующий на туберкулин крупный рогатый скот, установили наличие больных туберкулезом кур (45 голов), а в одном дворе - и больных туберкулезом гусей. Также выявили 15 случаев микобактериоза свиней, обусловленного М. аvium. Свиньи выявлены во дворах, где содержалась больная туберкулезом птица.

Таким образом, результаты исследований показывают, что в сельских очагах туберкулеза в отдельных случаях выявляли животных, инфицированных возбудителем туберкулеза бычьего вида, в некоторых случаях - микобактериозы свиней и туберкулез птицы. По-видимому, целесообразно ввести понятие «сельский дворовый смешанный очаг туберкулеза» при наличии больного человека и больных туберкулезом или микобактериозом животных.

2.2.6. Совершенствование системы противотуберкулезных меро-приятий в сельских очагах туберкулеза

В нормативных документах недостаточно освещены вопросы эпиде-миологического и эпизоотологического обследования очагов туберкулеза, а так же отсутствует понятие микобактериоз как нозологическая единица. Поэтому актуальным является проведение эпидемиолого-эпизоото-логического обследования сельских очагов туберкулеза, которое должно осуществляться при выявлении каждого случая инфекции. Это обследование предусматривает разрешение нескольких задач:
- необходимо выяснить причины возникновения инфицирования, выявить источник возбудителя инфекции, пути его передачи и факторы, способствовавшие заражению макроорганизма. Для этого проводят осмотры граждан и аллергические исследования всех видов животных, находящихся в очаге туберкулеза. Медицинские и ветеринарные службы взаимно извещают вышестоящие органы о каждом случае вновь выявленных больных туберкулезом людей и животных, совместно проводят обследование очага;
- необходимо определить степень эпидемической и эпизоотической опасности источника возбудителя инфекции, находящегося в очаге туберкулеза, определить возможности его локализации и предупреждения распространения заболевания, т.е. установление границы очага, объекты внешней среды, которые могли быть заражены, при этом следует учитывать, что по степени эпидемической и эпизоотической опасности следует обозначить «сельский дворовый смешанный очаг туберкулеза» с выявленным больным или инфицированным человеком, животным, птицей и источником инфицирования (вид микобактерий);
- результатом обследования должна быть разработка комплексного плана санитарно-противоэпидемических и противоэпизоотических меро-приятий, в которых определяют порядок и время проведения текущей и заключительной дезинфекции, ревакцинации БЦЖ и химиопрофилактики. В плане также должны быть определены меры по обеззараживанию помещений и прилегающей территории, где находились больные туберкулезом животные. Результаты обследования и планируемые мероприятия учитываются в карте.

Проведение комплексных медико-ветеринарных мероприятий в очаге позволит устранить действие возможных дополнительных источников инфицирования человека и животных, повысить их эффективность.

2.2.7. Получение микобактериального антигена.

Учитывая эффективность использования иммуноферментного анализа при диагностике инфекционных заболеваний и результаты, полученные рядом исследователей, совместно с сотрудниками РНИУП Института экспериментальной ветеринарии им. Вышелесского НАН Республики Беларусь проводили исследования по совершенствованию методик получения компонентов, используемых в тест-системе конкурентного иммуноферментного анализа. (Т.Н. Агеева, 2005).

С помощью перекрестного электрофореза удалось обнаружить 20 антигенов, стимулирующих выраженный гуморальный ответ.

При постановке серологических тестов с антигенами, полученными из разных клеточных структур микобактерий, было установлено, что наибольшую активность в реакциях проявляют препараты, содержащее компоненты клеточных стенок. Нами были обнаружены и идентифицированы ряд антигенов микобактерий, выявляющих антитела у инфицированньх животных, которые затем были получены в частично очищенном виде и названы как иммунодоминантные (ИДА). Методом ультразвуковой дезинтеграции клеточных стенок микобактерий с последующим фракционированием на сефадексе G-100 и G-200 были выделены наиболее активные ИДА, которые находились во фракциях с молекулярной массой более 100 кДа.

Изучение свойств иммунодоминантных антигенов подтвердило их преимущественную локализацию в клеточной стенке, и были получены ИДА разных видов микобактерий (М. bovis, М. tuberculosis и смеси четырех штаммов атипичных микобактерий). Несмотря на то, что большая часть иммунодоминантных антигенов являлась общеродовой, с помощью очищенных антител бычьей антисыворотки М. bovis, не дававших перекрестных реакций с антигенами атипичных микобактерий, выявлены имеющиеся на них видоспецифические эпитопы. Диагностическое значение видоспецифических эпитопов ИДА было подтверждено в дальнейшем иммунологическими тестами с сыворотками крови коров, инфицированных возбудителем туберкулеза и атипичными микобактериями.

Так как специфические антитела на ИДА диагностируются раньше в серологических тестах, чем развивается аллергия к туберкулину, то для выявления инфицированных возбудителем туберкулеза животных, не реагирующих на туберкулин, и установления причин реакций на туберкулин у реагирующего крупного рогатого скота был разработан вариант ИФА с использованием ИДА М. bovis, М. tuberculosis и атипичных микобактерий.

2.2.8. Оптимизация технологии получения конъюгата для имму-ноферментного анализа при диагностике туберкулеза.

Для успешной постановки ИФА имеет качество конъюгата. Основным условием высокой специфичности конъюгатов является использование очищенной фракции и иммунизация животных без использования вакцины БЦЖ (полный адъювант Фрейнда).

Получение анти-IgG КРС иммунопероксидазного коньюгата проводили по усовершенствованной схеме: выделение IgG из нормальной сыворотки крови КРС аффинной хроматографией на протеин-А Сефарозе 4В в один этап; получение антивидовых сывороток на кроликах и баранах; выделение анти- IgG антител на протеин-А Сефарозе 4В; мечение антивидовых антител ферментом пероксидазой. Для получения специфических антивидовых сывороток крови иммунизировали здоровых кроликов и баранов раствором иммуноглобулина Ig G (О,5 мг/мл) и смесью равных частей иммуноглобулина с препаратом полиэлектролита - полиоксидония по методике, разработанной в отделе иммунологии ГНУ ВНИТИБП доктором, профессором В.И. Клюкиной. Выделение фракции анти- IgG КРС антител проводили на протеин-А Сефарозе 4В.

Анти-IgG пероксидазный коньюгат с рабочим разведением 1:10000, концентрацией по ПХ 210 мкг/см3 и ОП450 1,1730?0,011 в гомологичной системе, был использован в тест-системе для выявления специфических противотуберкулезных антител к антигенам в непрямом варианте ИФА. Аналогично разработали технологию получения другого коньюгата: меченые пероксидазой бараньи антивидовые IgG -антитела к IgG кролика. Этот коньюгат использован в дальнейших исследованиях при постановке конкурентного варианта ИФА.

2.2.9. Получение специфической противотуберкулезной сыворотки

Для получения иммунной сыворотки использовали иммунодоминантные антигены возбудителя туберкулеза.

Качество и специфичность полученных противотуберкулезных сывороток изучали в непрямом методе ИФА с гомологичным микобактериальным антигеном. При иммунизации кроликов получали гипериммунные сыворотки примерно с равными титрами специфических антител (средний титр в ИФА 1:30000-50000). С помощью аффинной хроматографии выделяли пул антител к M. bovis, которые в последующем использовали в качестве блокирующей тест-сыворотки при постановке Б-ИФА.

2.2.10. Изучение эпизоотической ситуации с помощью жидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа.

Методом последовательных разведений определили рабочие концентрации блокирующих антител (БА)-1:1000; антивидового конъгата -1:3000, антигена 1:200. Для количественного анализа установили позитивно-негативный порог и для повышения специфичности системы с учетом возможных погрешностей выделили сомнительную зону (Б %=30-40).

По уровню снижения оптической плотности кроличьих тест-антител в Б-ИФА сыворотками крови коров, реагировавших на туберкулин, определяли наличие в них антигенов возбудителя и судили об инфицированности животных. Процент блокирования кроличьих тест-антител к M.bovis положительными контрольными сыворотками по сравнению с процентом блокирования (Б %) отрицательным контролем составили: сывороткой крови заведомо известной больной коровы 66+1,1%, положительной контрольной сывороткой - 51+1,7%, гипериммунной антисывороткой M.bovis-48+2,2 %, гипериммунной сывороткой к антигенам атипичных микобактерий - 29—39%.

В стадах угрожаемой и неблагополучной ситуации по туберкулезу в Московской области (345 обследованных коров) выявили 21% из исследованных проб сыворотки крови, показавших явно положительную реакцию с высоким процентом блокирования.

В среднем процент Б % составил по стаду 50,2+2,7 с колебаниями от 42% до 64%. Такой высокий уровень блокирования свидетельствовал о наличии активного туберкулезного процесса.

3. ВЫВОДЫ

1. Ретроспективный анализ динамики проявления эпидемического процесса туберкулеза подтвердил тенденцию к увеличению показателей заболеваемости населения Московской области. Эпизоотический процесс туберкулеза крупного рогатого скота в Московской области не прерывается, о чем свидетельствуют появление новых очагов с выявлением больных туберкулезом животных. Это объясняется несвоевременной диагностикой.

2. Анализ результатов бактериологических исследований биомате-риала от сельскохозяйственных животных подтверждает особенности ту-беркулеза как межвидовой инфекции. Установлена миграция возбудителей туберкулеза среди разных видов животных, но не выявлена их миграция на человека. Это свидетельствует о самостоятельном развитии эпидемического и эпизоотического процессов туберкулеза.

3. Подтверждена убиквитарность нетуберкулезных микобактерий, которых выявляли из объектов внешней среды и из биоматериала реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота.

4. Микобактериозы свиней регистрировали в отдельных свиноводческих комплексах Московской области с пораженностью от 71,2% до 81,2% животных. Источником заражения свинопоголовья являлся торф, исключение которого из рациона предотвратило в дальнейшем появление аллергических реакций на туберкулин и патологию у животных.

5. Усовершенствована система противотуберкулезных мероприятий в сельских очагах туберкулеза, объединяющая усилия медицинских и ветеринарных специалистов, позволяющая предотвратить появление и распространение туберкулеза и микобактериозов.

6. При постановке серологических тестов с антигенами, приготов-ленными из разных клеточных структур микобактерий, было установлено, что наибольшую активность в реакциях ИФА проявляют препараты, содержащее компоненты клеточных стенок. Были обнаружены и идентифицированы ряд антигенов микобактерий, выявляющих антитела у инфицированньх животных, которые затем были получены в частично очищенном виде и названы как иммунодоминантные (ИДА).

7. При иммунизации кроликов иммунодоминантными антигенами M. bovis получали гипериммунные сыворотки с титрами специфических антител (средний титр в ИФА 1:30000-50 000). Выделенный пул антител к M.bovis использовали в качестве блокирующей тест-сыворотки при постановке Б-ИФА.

8. В стадах угрожаемой и неблагополучной ситуации по туберкулезу в Московской области (345 обследованных коров) выявили 21% из исследованных сывороток крови, показавших положительную реакцию с высоким процентом блокирования в ИФА. В среднем процент Б% составил по стаду 50,2+2,7 с колебаниями от 42% до 64%. Такой высокий уровень блокирования свидетельствовал о наличии активного туберкулезного процесса.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предлагаются для практики:
- методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденных директором ВИЭВ, академиком РАСХН М.И. Гулюкиным, директором ВНИТИБП, академиком РАСХН А.Я. Самуйленко и директором «Центра ветеринарии» Л.К.Кишем 25 мая 2009г.;
- «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций у животных», утвержденные директором ВИЭВ, академиком РАСХН М.И.Гулюкиным 22 марта 2007г.;
- «Планы профилактических и диагностических мероприятий по профилактике туберкулеза в Московской области», утвержденные Глав-ным врачом областного противотуберкулезного диспансера Московской области Г.Б. Касаткиным в 2008 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хруленко В.Н. Бактериологическая диагностика туберкулеза животных /Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, М.В.Калмыков, Е.Э. Соколова, Н.В. Мельник, С.А. Коломыцев// Ветеринария. - 2006.-№12.- С.3-5.

2. Хруленко В.Н. Туберкулез как международная и национальная медико-ветеринарная проблема в современных условиях / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Н.А. Яременко, П.П. Рахманин, Н.В.Мельник, С.В.Крюков, В.Н.Боровой // Ветеринарный врач.-2009-№2- С.- 14-17.

3. Хруленко В.Н. К вопросу взаимовлияния эпидемического и эпизоотического процессов туберкулеза и микобактериозов в Московской области / Н.П.Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г.Толстенко, Е.А.Касьянова, Е.Э.Соколова, М.А.Аникеев // Ветеринарный врач.- 2009.-№6. -С.17-20.

4. Хруленко В.Н. Совершенствование системы противотуберкулезных мероприятий в сельских очагах туберкулеза / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, С.В. Крюков, Н.В. Мельник, Т.Х. Фаизов, Е.Э.Соколова //Ветеринарный врач.- 2009.- №4 -С.37-39.

















Ремонт холодильников



Шкафы-купе, кухни



Ремонт комнат, ванных